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小鼠Ly6G抗體體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞，你清楚嗎？

更新時(shí)間：2025-06-23 點(diǎn)擊次數(shù)：453次

中性粒細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的白細(xì)胞，約占成人外周血白細(xì)胞的60-70%，小鼠中約為10-25%，是先天免疫的重要組成部分。中性粒細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性和可塑性，在體內(nèi)發(fā)揮著多種看似矛盾的保護(hù)與致病作用，是一把“雙-刃劍"。一方面中性粒細(xì)胞是抗菌防御的重要效應(yīng)細(xì)胞，通過吞噬、脫顆粒作用和形成胞外陷阱（NET）等方式消滅潛在病原體，另一方面它們?cè)诮M織修復(fù)、纖維化相關(guān)的致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能^[1,2]。

中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也扮演著復(fù)雜的角色，它們可以直接釋放活性氧、金屬蛋白酶等毒性物質(zhì)或調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)配體來消除腫瘤細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)間接抑制腫瘤進(jìn)展，但同時(shí)自己也經(jīng)歷重編程，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、血管生成和腫瘤生長(zhǎng)^[2-4]。中性粒細(xì)胞多樣而復(fù)雜的功能，使其成為近年免疫學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，已經(jīng)有多項(xiàng)在研的癌癥免疫療法靶向中性粒細(xì)胞^[2-4]。

圖1 截至2024年12月31日，在PubMed用 “neutrophil" 檢索到的文獻(xiàn)數(shù)量，2020年開始激增。

中性粒細(xì)胞存活時(shí)間短，更新速度快，增加了研究的技術(shù)難度。近年來單細(xì)胞分析技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了對(duì)中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的深入研究。而要在體內(nèi)證明是中性粒細(xì)胞起作用，一種廣泛使用的經(jīng)典方法是給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，比如小鼠注射Ly6G抗體，在體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞，再進(jìn)一步進(jìn)行功能檢測(cè)，比如檢測(cè)清除中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤體積的影響。

小鼠Ly6G是一種糖基化的磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞表面蛋白，通常在單核細(xì)胞發(fā)育過程中瞬時(shí)表達(dá)，而在成熟粒細(xì)胞和外周血中性粒細(xì)胞持續(xù)表達(dá)。其1A8單克隆抗體特異性地與小鼠Ly6G反應(yīng)，被廣泛用于體內(nèi)中性粒細(xì)胞清除^[5]。

表1 小鼠Ly6G抗體1A8比Gr-1抗體RB6-8C5更特異地在體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞，對(duì)循環(huán)淋巴細(xì)胞影響較小^[5]。

小鼠Ly6G抗體體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞，你清楚嗎？

Bio X Cell公司具有超過25年的單克隆抗體及重組蛋白的生產(chǎn)和定制經(jīng)驗(yàn)，提供高純度、低內(nèi)毒素、無(wú)防腐劑的單克隆抗體，適用于各種臨床前功能實(shí)驗(yàn)，尤其是動(dòng)物體內(nèi)研究。

Bio X Cell提供的兩種小鼠Ly6G抗體克隆1A8產(chǎn)品，InVivoMAb anti-mouse Ly6G（#BE0075-1）和InVivoPlus anti-mouse Ly6G（#BP0075-1），據(jù)CiteAb網(wǎng)站數(shù)據(jù)，截至2024年底，已分別被296篇和88篇文獻(xiàn)引用，展現(xiàn)了良好的中性粒細(xì)胞體內(nèi)清除效果。兩者純度都大于95%，且經(jīng)過0.2μm過濾，消除內(nèi)毒素和疊氮化合物的影響。InVivoPlus系列內(nèi)毒素更低至1EU/mg以下（InVivoMAb為<2EU/mg），而且額外經(jīng)過生物學(xué)結(jié)合驗(yàn)證、小鼠病原體檢測(cè)和單體率檢測(cè)。

表2 Bio X Cell小鼠Ly6G抗體（1A8克?。┎糠煮w內(nèi)應(yīng)用文獻(xiàn)。

這里選取三篇2024年的高分文獻(xiàn)，介紹Ly6G抗體在小鼠體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞的具體應(yīng)用和研究發(fā)現(xiàn)，以供參考。

CD49f高表達(dá)肝癌細(xì)胞亞群免疫逃逸機(jī)制^[6]

來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院-上海市腫瘤研究所覃文新研究員/王存研究員團(tuán)隊(duì)和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院高強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)的Cancer Cell論文。

研究人員首先鑒定到CD49f是肝細(xì)胞癌中腫瘤起始細(xì)胞（TIC）的一個(gè)顯著的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)CD49f高表達(dá)TIC通過CXCL2-CXCR2軸特異性招募中性粒細(xì)胞形成免疫抑制微環(huán)境。

隨后為了確定中性粒細(xì)胞是否反過來影響TIC表型，用Hep53.4-GFP細(xì)胞建立小鼠原位肝癌模型，按10mg/kg或7.5mg/kg注射InVivoMAb anti-mouse Ly6G抗體或同等劑量的同型對(duì)照InVivoMAb rat IgG2a（#BE0089）。結(jié)果顯示Ly6G抗體成功清除中性粒細(xì)胞，并且相比對(duì)照組顯著削弱了Hep53.4細(xì)胞的致瘤潛能，同時(shí)降低了腫瘤中CD49f腫瘤細(xì)胞的比例，說明中性粒細(xì)胞對(duì)維持TIC表型也非常重要。

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圖2 第一行從左至右，實(shí)驗(yàn)流程示意，極限稀釋法檢測(cè)Hep53.4細(xì)胞致瘤潛能，以及CD49f+GFP+細(xì)胞的占比。第二行，流式細(xì)胞分析驗(yàn)證C57BL/6小鼠外周血和腫瘤中的中性粒細(xì)胞清除效率（每組n=6只小鼠）。

中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成的調(diào)控機(jī)制^[7]

這項(xiàng)發(fā)表在Nature上的研究發(fā)現(xiàn)髓樣抑制性C型凝集素樣受體（MICL）是NET的重要模式識(shí)別受體，MICL識(shí)別NET后能夠抑制中性粒細(xì)胞活化和NET的進(jìn)一步形成，高水平的MICL自身抗體可能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病進(jìn)展相關(guān)。

研究人員用Micl-/-小鼠構(gòu)建了CAIA（collagen antibody-induced arthritis）的RA模型，Micl敲除小鼠出現(xiàn)了增強(qiáng)以及非緩解的關(guān)節(jié)炎表型，流式分析發(fā)現(xiàn)其關(guān)節(jié)組織中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞特異性增多而且高度活化。

為了探究中性粒細(xì)胞在RA進(jìn)展中的作用以及和MICL的關(guān)系，研究人員從注射ArthritoMab單抗雞尾酒后的第5天起，每48小時(shí)給小鼠注射500μg的Ly6G抗體（克隆1A8，Bio X Cell）或rat IgG2a同型對(duì)照，發(fā)現(xiàn)清除中性粒細(xì)胞后野生型小鼠和Micl-/-小鼠的臨床疾病都顯著減輕，而且程度相當(dāng)，說明Micl敲除小鼠的RA病理進(jìn)展是由中性粒細(xì)胞引起的。

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圖3 上圖, CAIA模型中性粒細(xì)胞清除策略。左下圖, 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)第9天外周血中的中性粒細(xì)胞（CD45+CD11b+F4/80-SSChigh），1次實(shí)驗(yàn)每組3只小鼠。右下圖，小鼠的嚴(yán)重程度評(píng)分，1次實(shí)驗(yàn)每組5只小鼠。

中性粒細(xì)胞來源遷移體在凝血中的關(guān)鍵作用^[8]

來自清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院俞立教授團(tuán)隊(duì)。遷移體是俞立團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并命名的遷移細(xì)胞的細(xì)胞器，近期這篇Nature Cell Biology論文報(bào)道了遷移體在凝血中的新功能。

作者發(fā)現(xiàn)人和小鼠血液中存在大量中性粒細(xì)胞來源的遷移體，這些遷移體表面吸附和富集凝血因子，還高度富集粘附分子，能夠迅速聚集到損傷部位激活血小板促進(jìn)凝血反應(yīng)。

隨后為了在體內(nèi)測(cè)試中性粒細(xì)胞來源遷移體在凝血中的作用，使用InVivoPlus anti-Ly6G抗體和同型對(duì)照InVivoPlus rat IgG2a（#BP0089）腹腔注射小鼠，初始劑量200μg，隨后每周三次給藥100μg。流式分析驗(yàn)證Ly6G抗體處理后絕大多數(shù)中性粒細(xì)胞被清除，而血小板的數(shù)量未受影響。結(jié)果體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞顯著增加了小鼠尾尖流血的出血量，而體內(nèi)注射純化的中性粒細(xì)胞來源遷移體能夠恢復(fù)中性粒細(xì)胞清除小鼠的凝血功能，表明中性粒細(xì)胞來源遷移體在體內(nèi)凝血過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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圖4 第一行, 小鼠全血細(xì)胞流式分析，以及中性粒細(xì)胞來源遷移體成像流式分析驗(yàn)證中性粒細(xì)胞清除。第二行，清除中性粒細(xì)胞或血小板之后小鼠尾尖出血量增加。第三行，注射中性粒細(xì)胞來源遷移體恢復(fù)中性粒細(xì)胞清除小鼠的凝血。

討論：Ly6G抗體清除中性粒細(xì)胞的注意點(diǎn)

要確定具體實(shí)驗(yàn)中合適的抗體劑量和給藥頻率，需要考慮多種因素，比如小鼠品系年齡體重、疾病模型、研究期限以及環(huán)境因素等等，克隆1A8清除中性粒細(xì)胞的單次給藥劑量通常在7.5mg/kg到20mg/kg之間，可以參閱Bio X Cell產(chǎn)品豐富的引用文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

其次需要設(shè)置同型對(duì)照組消除背景，并進(jìn)行流式細(xì)胞分析，檢測(cè)體內(nèi)的清除效率。Bio X Cell為兩個(gè)系列的Ly6G抗體分別提供同系列的同型對(duì)照，InVivoMAb rat IgG2a isotype control（#BE0089）和InVivoPlus rat IgG2a isotype control（#BP0089）。

除了這些體內(nèi)抗體應(yīng)用的一般性原則，具體到Ly6G抗體清除中性粒細(xì)胞，有研究指出其在清除不同成熟度的中性粒細(xì)胞時(shí)可能效果不同，對(duì)未成熟中性粒細(xì)胞的清除效率較為有限，比如2023年的一篇Cell論文報(bào)道Ly6G抗體注射后小鼠MC38腫瘤內(nèi)仍有28%的中性粒細(xì)胞殘留，這部分細(xì)胞CD101和CXCR2低表達(dá)，CXCR4高表達(dá)，成熟度較低^[9]。而在背靠背的另一篇Cell論文中，由于免疫治療后中性粒細(xì)胞呈現(xiàn)更成熟的抗腫瘤表型，使用Ly6G抗體有效清除^[10]。

另外，2024年Science Immunology上的一項(xiàng)研究基于甲流病毒誘導(dǎo)的肺損傷模型鑒定了一群表達(dá)Ly6G的非典型巨噬細(xì)胞，打破了在成熟細(xì)胞中Ly6G表達(dá)限于粒細(xì)胞的慣有認(rèn)知^[11]。

彩蛋：Bio X Cell Ly6G抗體的體外應(yīng)用

除了體內(nèi)清除，小鼠Ly6G的1A8抗體克隆也廣泛應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化（IHC）、免疫熒光（IF）等體外分析實(shí)驗(yàn)。事實(shí)上也有研究者把Bio X Cell的1A8抗體用于間接法的IHC和IF實(shí)驗(yàn)，相比常規(guī)體外應(yīng)用的小包裝抗體性-價(jià)比超-高，同時(shí)也佐證了功能級(jí)抗體的特異性和靈敏度。

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圖5 小鼠Ly6G抗體（#BE0075-1）1：1500稀釋在KrasLSL-G12D/+;Trp53fl/fl（KP）和KrasFSF-G12D/+;Trp53Frt/Frt;Rosa26FSF-CreERT2;Nkx2-1fl/fl（KPN）小鼠腫瘤FFPE切片中的IHC圖像和陽(yáng)性細(xì)胞定量[12]。

圖6 小鼠Ly6G抗體（#BE0075-1）1：2000稀釋用于寄生蟲感染的小鼠肺組織冰凍切片IF實(shí)驗(yàn)圖像^[13]。

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